Люциферин Люцифераза

Русский вариант статьи переведённой авто переводчиком. Ниже есть оригинальная ссылка на английский сайт источник.

Нейробиология стероидов
Клаус Дамм , Методы в неврологии , 1994

Реагенты и растворы
Люциферин : приготовьте 10 мкМ маточный раствор, растворив 10 мг люциферина (Boehringer Mannheim, GmbH, Германия) в 2,57 мл H 2 O и 1 мл метанола. Хранить аликвоты при -20 ° C. Разбавьте H 2 O до 200 мкМ для процедуры анализа.

Буфер LUC: 100 м M KPO 4 (pH 7,8), 5 м M АТФ, 10 м M MgCl 2 . Делайте каждый раз свежим

Люминометр: Люминометры продаются рядом поставщиков, например, Lumat LB501 (Berthold Analytical Instruments, Нашуа, Нью-Хэмпшир).

1.
Добавьте 50 мкм л буфера LUC в прозрачные пластиковые пробирки.

2.
Добавьте 5-20 мкм л клеточного экстракта, поместите пробирки с помощью люминометра, и вводит 100 мкм л разбавленного люциферина .

3.
Прочтите RLU.

Биолюминесценция
Дж. Вудленд Гастингс , в книге источников по физиологии клетки (четвертое издание) , 2012 г.

Люциферин Люцифераза

VIIIC Биохимия и клеточная биология
Люциферин кишечнополостных, коэлентеразин, примечателен его широкое филогенетическое распределение, предположил служить в несветящихся организмах в качестве антиоксиданта. На самом деле медуза Aequorea получает целентеразин из своего рациона ( Haddock et al., 2001 ), поэтому он аналогичен витамину, за исключением того факта, что излучение света не является необходимым для жизни. В некоторых случаях (например, Renilla ) сульфатированная форма люциферина может встречаться в качестве предшественника или формы хранения и может быть преобразована в активный люциферин путем удаления сульфата с помощью кофактора 3’5′-дифосфаденозина. Активная форма также может быть поглощенным с помощью Са 2 +чувствительный связывающий белок, аналогичный связывающему белку динофлагеллят. В этом случае Са 2 + вызывает высвобождение люциферина , а затем мигающее, таким образом , отличается от Aequorea механизма.

Как описано выше, у Aequorea , Obelia и других гидромедуз люциферин и люцифераза (EC № 1.13.12.5) реагируют с кислородом с образованием стабильного пероксида (экуорина или обелина); хранится в фотоцитах, он остается готовым к завершению реакции ( Blinks et al., 1982; Charbonneau et al., 1985; Cormier et al., 1989; Shimomura, 2006 ). Кристаллическая структура этого интермедиата ( рис. 52.16 ) была определена как для Aequorea, так и для Obelia ( Head et al., 2000; Liu et al., 2000 ). Потенциал действия позволяет Ca 2+вступать в белок и связываться с ним, сдвигая или разрывая водородные связи, тем самым изменяя его конформационное состояние и позволяя реакции продолжаться, но без потребности в свободном кислороде на этой стадии. Связанный с ферментом циклический пероксид, диоксетанон, является постулируемым промежуточным продуктом; он разрушается с образованием возбужденного целентерамида, эмиттера, вместе с молекулой CO 2 . Сам фермент, называемый апоаэкуорином, может снова вступить в реакцию с целентеразином и кислородом с образованием нового экворина; он гомологичен кальмодулину ( Lorenz et al., 1991 ).

Войдите, чтобы загрузить изображение в полном размере
РИСУНОК 52.16 . Структура кальций-регулируемого фотобелка обелина. N-концевые α-спирали зеленые (внизу), а C-концевые — красные (вверху). Субстрат гидропероксикоэлентеразина представляет собой синюю палочку, расположенную между зеленой и красной α-спиралями.

(С разрешения Джона Ли.)
В ранней литературе сообщалось, что кишечнополостные могут излучать биолюминесценцию, даже если полностью лишены кислорода. Теперь объяснение очевидно: экворин — это промежуточный продукт, в котором субстрат уже прореагировал с кислородом, и клетки сохраняют его в стабильном состоянии; только кальций необходим для излучения света.

Примечательно, что in vitro свет, излучаемый этой изолированной системой, является синим с широким спектром с максимумом при ≈480 нм, тогда как in vivo излучение имеет зеленый цвет (λ max = 508 нм), а его спектр узкий. Это связано с другим белком со вторым хромофором, зеленым флуоресцентным белком.(GFP), который является эмиттером. Несколькими годами ранее было замечено, что фотоциты Aequorea проявляют зеленую флуоресценцию, соответствующую цвету их биолюминесценции. Джонсон и др. (1962) наблюдали синий цвет системы in vitro наряду с зеленой флуоресценцией экстрактов и предположили, что это может быть связано с поглощением и повторным испусканием. Morin и Гастингс (1971) отмечает , что выделенное photocytes запускаемого испускать Са 2 + испускается зеленый свет , тогда как, если лизируют , прежде чем Ca 2+кроме того, излучение было синим, и предполагалось, что это связано с безызлучательной (по типу Ферстера) передачей энергии зеленому флуоресцентному белку (GFP). Этот белок, хромофор которого образуется путем медленной (≈1 час, требуется кислород) посттрансляционной модификации трех центрально расположенных аминокислот ( Cody et al., 1993 ), таким образом связанных ковалентно, в настоящее время широко используется в качестве флуоресцентного маркера или репортерный ген (см. Приложения). Его кристаллическая структура ( рис. 52.17 ) выявляет удивительную структуру, похожую на фонарь ( Ormö et al., 1996; Yang et al., 1996 ).

Войдите, чтобы загрузить изображение в полном размере
РИСУНОК 52.17 . Кристаллическая структура GFP с хромофором в центре.

Общая реакция такова:

Совсем недавно было обнаружено, что похожие белки разного цвета встречаются у других кишечнополостных, включая кораллы, не связанные с биолюминесценцией; их использование в качестве репортеров было оценено ( Baird et al., 2000 ), а цветовые мутантные GFP обеспечили набор цветов, которые значительно расширяют возможности их применения ( Zhang et al., 2002 ).

Некоторые штаммы светящихся бактерий также используют дополнительный белок, благодаря чему цвет может быть либо с синим, либо с красным сдвигом, в зависимости от флуорофора, который, однако, не присоединен ковалентно, поэтому не подходит в качестве метки. Также было определено, что в этом случае изменение цвета не связано с передачей энергии по типу Ферстера; белок сам участвует в люциферазной реакции ( Eckstein et al., 1990 ).

Оптическая молекулярная визуализация
Дж. Напп , Ф. Алвес , в « Всесторонняя биомедицинская физика» , 2014 г.

4.01.4.4 Биолюминесценция на основе целентеразина
Люциферины целентератного типа или так называемые коэлентеразины являются производными имидазопиразинона. Целентеразины являются наиболее «популярными» из морских люциферинов (субстратов) и могут быть обнаружены в различных типах, например, у кишечнополостных или гребневиков. Люциферины Renilla (морские анютины глазки) ( Hori, Cormier, 1966 ) или Gaussia (морские веслоногие рачки) являются наиболее изученными целентеразинами. Они реагируют с субстратом целентеразином с образованием синего света (~ 480 нм) в АТФ-независимом процессе ( Jones et al., 1999 ).

Целентеразин часто служит хромофором фотопротеинов, таких как эккорин, первый известный фотопротеин, выделенный и охарактеризованный из медузы Aequorea victoria ( Shimomura et al., 1962 ). Интересно, что синее (469 нм) импульсное излучение экворина запускается ионами кальция. Фрагмент целентеразина экранирован в центральной полости экворина. Связывание двух ионов Ca 2 + открывает экворин, что приводит к высвобождению и разложению пероксида целентеразина на целентерамид и CO 2, сопровождающееся испусканием света. Экворин биолюминесценция очень уникальна тем , что не требует молекулярного кислорода для прохождения возбуждения (Шимомура и др., 1962 ). Секрет этой кислородно-независимой биолюминесценции был объяснен открытием того, что связанный с экворином целентеразин уже является оксигенированным промежуточным продуктом реакции, который стабилизирован в богатой энергией форме, готовой к высвобождению фотонов, запускаемому исключительно кальцием.

Визуализация и спектроскопический анализ живых клеток
Пьер Кордо , Ясна Криз , в « Методы энзимологии» , 2012 г.

4 Биолюминесцентная визуализация in vivo
Биолюминесценция — это естественная форма хемилюминесценции, при которой энергия выделяется в результате химической реакции в виде светового излучения ( рис. 7.3 ). Люциферазы , используемый в наших исследованиях принадлежит к семейству света , создающими ферментов , называемых Светлячок люциферазы. В наших экспериментах мы использовали новое поколение репортеров, репортерный вектор люциферазы pGL4. Эти синтетические ферменты нового поколения оптимизированы для лучшей экспрессии в клетках млекопитающих , снижения фона и за счет удаления скрытых регуляторных элементов ДНК, снижения риска аномальной транскрипции. Как показано на рис. 7.3Эти ферменты могут генерировать видимый свет в присутствии ферментоспецифического субстрата (в случае люциферазы светлячка это d- люциферин ), кислорода и АТФ в качестве источника энергии. В этой химической реакции d- люциферин превращается в оксилюциферин, а часть химической энергии превращается в видимый свет. В отличие от насекомых, некоторых бактерий и некоторых морских организмов, генетически модифицированные млекопитающие не производят люциферин. Поэтому перед каждым сеансом визуализации субстрат необходимо вводить мышам. d-люциферин нетоксичен, и после внутрибрюшинного (ip) введения он распределяется во всех тканях, включая мозг. Однако при рассмотрении стационарной биолюминесцентной визуализации структур мозга, чтобы избежать артефактов, очень важно получить стабильную концентрацию субстрата d- люциферина в мозге. Исходя из нашего опыта и нашей экспериментальной модели, требуется от 18 до 20 минут после внутрибрюшинной инъекции для получения стационарного биолюминесцентного сигнала от мозга мышей, подвергшихся инсульту. Поскольку эти значения могут зависеть от системы и модели, мы приводим здесь подробное описание экспериментальных процедур и несколько советов по успешной и достоверной биолюминесцентной визуализации .

Войдите, чтобы загрузить изображение в полном размере
Рисунок 7.3 . Схематическое изображение обнаружения биолюминесцентного источника из мозга живых мышей. В присутствии АТФ и магния люциферин связывается с люциферазой. Впоследствии высвобождение пирофосфата (PPi) после создания AMP будет генерировать люцифериладенилат. Этот аденилат будет окислен до нестабильной молекулярной формы после нескольких промежуточных стадий. Для достижения молекулярной стабильности фотон света будет выпущен и захвачен камерой CCD.

4.1 Подготовка материала: раствор люциферина для визуализации in vivo.
d — люциферин — это небольшая молекула, образующаяся в биолюминесцентных организмах. Он легко диффундирует через мембраны, включая гематоэнцефалический барьер, гемато-плацентарный барьер и гематоэнцефалический барьер . Кроме того, из-за его размера активация иммунной системы кажется маловероятной. Здесь важно отметить, что d-люциферин представляет собой молекулу, чувствительную к свету, кислороду и в форме порошка к влаге, поэтому важно минимизировать воздействие прямого света на порошок и раствор. По этим причинам мы рекомендуем работать с янтарными эппендорфами и / или перед экспериментами обернуть обычный прозрачный эппендорф алюминиевой фольгой, чтобы сохранить стабильность люциферина. Кроме того, чтобы сохранить качество и интенсивность биолюминесцентных сигналов стабильными, рекомендуется готовить свежий раствор люциферина перед каждым экспериментом. Однако оказалось , что в наших руках аликвоты, хранящиеся при -80 ° C, действительно хорошо работают. Их можно хранить не менее 6 месяцев без изменения эффективности. Чтобы избежать повторяющихся циклов замораживания и оттаивания, небольшие аликвоты по 1 мл хранят при -80 °. После оттаивания раствор люциферина выдерживают при 4 ° C и используют в течение следующих дней или двух.

Материал, необходимый для приготовления раствора люциферина :

•
Флакон с калийной солью d -люциферина светлячка.

•
d- фосфатный буферный раствор (PBS) (без Mg 2+ и Ca + ).

•
Шприцевой фильтр 0,2 мкм.

•
Шприц

•
Темный эппендорф

Люцифераза или люцифер

Процедура : растворяют d- люциферин в d- PBS, получая исходный раствор с конечной концентрацией 15 мг / мл. Например, растворите 1 г d- люциферина в 66,6 мл d- PBS. Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра, разделите основной раствор на небольшие аликвоты (рекомендуемый объем 1 мл) и храните при -80 ° C в темном эппендорфе до использования. Перед визуализацией разморозьте аликвоты на льду или на столе (оба работают одинаково хорошо) и введите 10 мкл / г веса тела ip. Мышь 20 г получит 200 мкл раствора. В целом взрослая мышь может получать ip до 1 мл раствора без проблем. Рекомендуемая доза составляет 150 мг / кг. Во избежание травм люциферин следует вводить (внутрибрюшинно), держа животное животом вверх, головой вниз. Это заставит движущиеся органы вверх по полости животного к диафрагме, сводя к минимуму риск укола или прокола органа. В наших экспериментах животным вводят инъекции в левый нижний квадрант брюшной полости с помощью шприца объемом 1 см3. Предотвращение травм и минимизация стресса — очень важный элемент, особенно в долгосрочном эксперименте с визуализацией, когда одни и те же животные визуализируются (и вводятся) в повторяющихся циклах. В наших долгосрочных экспериментах (3-4 месяца) мы обычно фотографируем одно и то же животное раз в неделю. На сегодняшний день, хотя мы провели несколько долгосрочных исследований изображений ( Gravel et al.,2011; Келлер и др., 2009, 2011; Lalancette-Hebert et al., 2009 ), мы не наблюдали какой-либо токсичности, вызванной люциферином.

4.2 Подготовка к сеансу визуализации
В биолюминесцентной визуализации планирование является ключом к успеху. Перед каждым сеансом визуализации, особенно при работе с более чем одной группой экспериментальных животных, мы предлагаем подготовить журнал, содержащий следующую информацию:

•
идентификационный номер и пол мыши

•
время субстрата d — инъекция люциферина

•
время индукции анестезии

•
время приобретения

Почему все эти элементы важны? Во-первых, некоторые тканевые реакции, такие как нейровоспаление после инсульта, зависят от пола и эстрогена ( Cordeau et al., 2008 ). Затем, при визуализации ответов головного мозга, люциферину требуется от 15 до 20 минут после внутрибрюшинной инъекции, чтобы преодолеть гематоэнцефалический барьер, и обычно требуется около 5 минут для анестезии одной мыши. Также важно отметить, что программирование времени сбора данных в 2 минуты займет чуть больше 2 минут. Например, с IVIS 200, если вы сделаете 2- минутный снимок биолюминесценции в поле зрения A (4 × 4 см, поле высокого разрешения), это займет примерно 150 s, прежде чем вы сможете открыть дверцу системы визуализации и поместить другое экспериментальное животное. Поскольку в некоторых экспериментах время пика экспрессии люциферазы, используемое в стационарной биолюминесцентной визуализации, может быть относительно коротким (5-10 мин), все эти параметры чрезвычайно важны для своевременных, достоверных и эффективных протоколов визуализации биолюминесценции in vivo .

4.3 Соответствующие контрольные группы
•
Определение кинетической кривой люциферина и времени пика экспрессии люциферазы

•
Создание базовой кривой

Чтобы выполнить качественную стабильную биолюминесцентную визуализацию in vivo для каждой новой трансгенной репортерной мыши и новой экспериментальной парадигмы, необходимо установить кинетическую кривую люциферина и время пика экспрессии люциферазы. Например, при визуализации активации микроглии / врожденного иммунного ответа после инсульта у мышей-репортеров TLR2 ( Lalancette-Hebert et al., 2009 ) кинетическая кривая люциферина и время пика экспрессии люциферазы не будут одинаковыми, если мы будем использовать разные модели инсульта, которые есть постоянная окклюзия СМА по сравнению с временной окклюзией СМА. Кроме того, эти важные параметры могут измениться, если мы визуализируем животных после инсульта с использованием разных репортерных линий мыши, таких как GFAP-luc и / или GAP-43-luc / gfp ( Cordeauet al., 2008; Gravel et al., 2011 ). Поэтому мы рекомендуем перед каждым экспериментом устанавливать кинетическую кривую люциферина и время пика экспрессии люциферазы. А именно, перед введением в любую новую экспериментальную парадигму по крайней мере 3-5 трансгенных репортерных мышей должны быть инъецированы люциферином и визуализированы каждые 5 минут в течение 40-45 минут. После того, как данные визуализации будут собраны и должным образом проанализированы, будет легко рассчитать кинетику и пиковую экспрессию люциферазы и оценить продолжительность устойчивого состояния, которое будет использоваться в экспериментах по визуализации.

Помимо контроля кинетики люциферина, для каждой модели трансгенных мышей важно проанализировать уровень базовой экспрессии репортерного гена. В зависимости от выбранного промотора гена существует вероятность того, что даже в контрольных условиях (без инсульта) мы можем наблюдать базовый биолюминесцентный сигнал. По этой причине в каждом эксперименте с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo важно установить базовую кривую и сравнить все полученные результаты визуализации с соответствующими контролями.

4.4 Протокол для 2D- визуализации биолюминесценции in vivo
В наших протоколах визуализации мы используем систему визуализации IVIS® 200 (CaliperLS, Аламеда, Калифорния, США); однако описанная здесь последовательность событий может быть применена к любой из систем визуализации, адаптированных для получения биолюминесцентных изображений in vivo целиком мелких животных . Как описано ранее ( Cordeau, et al., 2008 ), за 25 минут до сеанса визуализации мыши будут получать внутрибрюшинную инъекцию субстрата люциферазы d — люциферина (150 мг / кг — для мышей весом от 20 до 25 г, 150–187,5). Вводили мкл раствора 20 мг / мл d- люциферина, растворенного в 0,9% физиологическом растворе) (CaliperLS). В нашем эксперименте мы всегда используем d-люциферин от того же поставщика ( примечание : хотя источник люциферина определяется конечным пользователем, после начала экспериментов мы не рекомендуем менять источник). Через 10-15 минут после инъекции люциферина мышей анестезировали 2% изофлураном в 100% кислороде при скорости потока 2 л / мин, помещали в нагретую, светонепроницаемую камеру для визуализации и поддерживали анестезию путем постоянной подачи 2% изофлурана / кислородной смеси со скоростью 1 л / мин через коллектор для анестезии IVIS® (коллектор для анестезии и адаптеры обычно зависят от системы, но одинаково эффективны). Изображения собираются с помощью высокочувствительной (CCD) камеры с длинами волн от 300 до 660 нм. Время экспозиции для визуализации обычно 1-2 мин с использованием другого поля зрения и диафрагмы объектива f / 1. Мы рекомендуем начать протокол с настройками по умолчанию для биолюминесценции in vivo , которые обычно составляют 1 мин / среду. Первые биолюминесцентные изображения и измерения обычно предоставляют нам исходную информацию об интенсивности сигнала, и затем эти параметры будут соответствующим образом скорректированы. Для визуализации сигналов биолюминесценции от мозга мы обычно используем более высокое разрешение / чувствительность, поле зрения 4 × 4 см. Сосредоточение внимания на голове позволяет получить более подробные изображения сигнала, исходящего из мозга, чем изображение всей мыши ( Cordeau et al., 2008; Gravel et al., 2011; Lalancette-Hebert et al., 2009).). Как описано ранее, биолюминесцентное излучение нормализуется и отображается в физических единицах яркости поверхности, фотонов в секунду на квадратный сантиметр на стерадиан (фотоны / с / см 2 / ср), как это обычно бывает при визуализации биолюминесценции ( Kadurugamuwa et al., 2005; Zhu et al., 2004 ). Светоотдача определяется количественно путем определения общего количества фотонов, испускаемых в секунду, с использованием программного обеспечения для сбора и визуализации Living Image 2.5 (CaliperLS). Измерения области интереса (ROI) на изображениях используются для преобразования яркости поверхности (фотоны / с / см 2 / ср) в поток источника или общий поток фотонов, выраженный в фотонах / секундах (п / с). Запись: Для стандартизации сбора данных очень важно использовать одни и те же измерения ROI с течением времени. При визуализации биолюмиенсценции данные обычно представлены в виде псевдоцветных изображений, показывающих интенсивность света (красный и желтый, наиболее интенсивный или любой другой цветовой код), и наложены на эталонные фотографии в градациях серого. После инсульта мы обычно рекомендуем визуализировать / анализировать острую фазу (до 72 часов после первоначального инсульта), за которой следует более поздняя стадия реакции ткани на ишемическое повреждение. Большим преимуществом биолюминесценции in vivo и в целом оптической визуализации является то, что одно и то же животное можно было визуализировать с течением времени. Более того, используя этот подход, мы можем визуализировать пространственную и временную динамику различных элементов ответа мозга на ишемическое повреждение.

4.5 Протокол трехмерной реконструкции биолюминесцентных источников
Хотя биолюминесцентная визуализация является мощным инструментом для исследований изображений мелких животных, следует помнить о некоторых ограничениях при использовании этого подхода. Мы уже обсуждали здесь трудности обнаружения люциферазы на клеточном уровне. Другая потенциальная проблема — точное обнаружение сигнала от более глубоких структур мозга. А именно, изображения биолюминесценции обычно двумерные (2D), и поскольку свет ослабляется примерно в 10 раз / см ткани, свет от поверхностных источников будет обнаруживаться в большей степени, чем свет от более глубоких структур ткани ( Contag and Bachmann , 2002; Люкер, Люкер, 2010). При визуализации инсульта это может повлиять на сигналы, исходящие от инфаркта кортикального слоя по сравнению с полосатым телом. Чтобы преодолеть эту проблему в наших экспериментах по визуализации, мы используем протокол для трехмерного представления наших сигналов. Техника называется диффузно-люминесцентной томографией (DLIT). Как описано ранее ( Cordeau et al., 2008 ), для получения трехмерных изображений мы получали фотографии в оттенках серого и изображения структурированного света, за которыми следовали серии биолюминесцентных изображений с использованием различных длин волн (560–660 нм). Трехмерная реконструкция биолюминесцентных источников в головном мозге обычно выполняется с использованием алгоритмов DLIT (программное обеспечение для анализа живых изображений 3D, CaliperLS).

Диффузная томография — это метод, который анализирует свет, генерируемый и проецируемый на поверхность мышей, для воссоздания трехмерной реконструкции зоны, генерирующей тот же свет. Для создания трехмерного изображения необходимо получить структурированное световое изображение мыши. Структурированное световое изображение состоит из серии параллельных лазерных линий, проецируемых на мышь, чтобы определить поверхность мыши. После этого программа проанализирует смещение лазерного луча, чтобы воссоздать 3D-мышь. Это смещение используется для определения топографии поверхности мыши с использованием многоугольников. Поэтому, чтобы удалить любые артефакты, которые могут быть созданы программным обеспечением, мы рекомендуем расчесать или побрить мышей перед структурированием световых изображений. После создания трехмерной поверхности мыши программное обеспечение теперь может локализовать и количественно определить источник света с помощью мыши. Для этого требуется минимум два фильтра выбросов (560–660 нм) необходим для локализации источника света. Используя различные длины волн, фермент с определенными спектрами излучения (в нашем случае генетически модифицированную люциферазу светлячка) и известные свойства тканей (кости, мышцы, мозг и т. Д.), Программа может рассчитать и сопоставить яркость поверхности с плотностью фотонов для на каждой длине волны. Следующим шагом является разделение внутренней части мыши на вокселы и присвоение каждому вокселю правильной силы источника для генерации плотности фотонов, измеренной на каждом элементе поверхности мыши ( Contag and Bachmann, 2002 ). В нашей предыдущей работе и как показано здесь на рис. 7.4, мы протестировали несколько протоколов для трехмерной биолюминесцентной визуализации. Наш анализ был дополнительно подтвержден измерениями иммуногистохимии и показал, что трехмерная реконструкция с использованием алгоритмов DLIT является довольно точной методологией ( Cordeau et al., 2008 ).

Войдите, чтобы загрузить изображение в полном размере
Рис. 7.4 . Трехмерная реконструкция биолюминесцентных сигналов, испускаемых из мозга трехмесячной мыши TLR2-luc / gfp через 24 часа после MCAO. Реконструкция строится с использованием трех разных длин волн (600, 620 и 640 нм) в спектре излучения биолюминесцентного источника (программное обеспечение Living Image, Xenogen). Зеленая область, сконцентрированная в ишемическом поражении, представляет области мозга с наибольшей эмиссией фотонов, следовательно, наибольшей активацией TLR2. Шкала справа — это цветные карты интенсивности источника в фотонах в секунду. Вставка изображения была сделана с полем обзора A с 2- минутной экспозицией до изображения последовательности 3D.

Лентивирусная трансдукция генных меток в бластоцистах
Сюцзюнь Фань , Нихар Р. Наяк , в Руководстве по исследованию беременности мышей , 2014 г.

Анализ BLI (Fluc)
Приготовьте капли KSOM по 20 мкл, содержащие D- люциферин (50 мкг / мл), в чашке для культивирования диаметром 60 мм, покрытой легким минеральным маслом, и уравновесите при 37 ° C и 5% CO 2 .

Вымойте трансдуцированные бластоцисты в первой капле, а затем перенесите по одной бластоцисте в каждую каплю.

Поместите пластину в светонепроницаемую камеру системы IVIS 200 и измерьте количество фотонов, испускаемых каждой бластоцистой (количество фотонов в секунду на квадратный сантиметр на стерадиан, п / с / см 2 / ср) ( рис. 1 (C) ).

Бластоцисты, оптимально преобразованные с помощью LV-Fluc / Tomato, отбираются на основе диапазона потоков фотонов (2,0E + 4 — 6,0E + 4 п / с / см 2 / ср), определенных в пилотных экспериментах 5, и передаются реципиентам. Обратите внимание, что диапазон потоков фотонов может различаться для разных вирусов и должен определяться для каждого лентивируса .

Бициклические системы с плавкими предохранителями 5-5 и 5-6 с хотя бы одним плацдармом (кольцевое соединение) N
AC Regan , в Комплексной гетероциклической химии III , 2008 г.

11.12.9.2.1 Замыкание имидазольного кольца
Коэлентеразин 191 , важный природный биолюминесцентный люциферин , был синтезирован с использованием как установленного метода взаимодействия 2-аминопиразина 188 с глиоксалем 189 <1997CC323> , так и использования избытка коммерчески доступной п- гидроксифенилпировиноградной кислоты 190 вместо из альдегида 189 <1998H (48) 1 669> (уравнение 28 ). Пировиноградная кислота 190 также появляется , чтобы служить в качестве восстанавливающего агента и исключает необходимость синтеза многоступенчатого из 189 .

(28)
Трехкомпонентный метод сочетания типа Ugi получает широкое распространение для получения этой кольцевой системы и включает реакцию между 2-аминопиразином 192 , альдегидом и изонитрилом с образованием 193 за одну стадию (уравнение 29 ) <1998AGE2234, 1998SL661> . Замена 2-аминопиразина 192 на 2-аминопиримидин также позволяет синтез кольцевой системы 67 ( раздел 11.12.9.5.1 ). Для ускорения этой реакции можно использовать трифлат скандия вместо протонной кислоты <1998TL3635> . Метод хорошо подходит для высокопроизводительного параллельного синтеза., и был выполнен с изонитрильным компонентом, прикрепленным к твердой подложке <1998TL5469, 2001SL1263> . Эти реакции сочетания ускоряются микроволновым облучением в присутствии либо монтмориллонитовой глины <1999TL7665>, либо трифлата скандия <2003TL4369> .

(29)
Получение 2-незамещенных продуктов этим методом потребует использования формальдегида в качестве альдегидного компонента, что дает низкие выходы. Однако использование глиоксиловой кислоты либо в виде свободной кислоты, либо связанной с макропористым карбонатом полистирола , приводит к удовлетворительному образованию 2-незамещенных продуктов посредством декарбоксилирования in situ <2004OL4989> . Сообщалось об использовании неполярного растворителя (толуола) для уменьшения образования побочных продуктов в реакции этого типа <2006TL947> .

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
LJ Kricka , в Энциклопедии аналитической науки (второе издание) , 2005 г.

Ренилла
Море фиалка , Renilla reniformis , содержит люциферазы ( К м люциферин = 30 нмоль л -1 , оптимум рН ~7.6), A люциферин-связывающий белок (18,5 кДа, два Са 2+ сайты связывания) , что секвестры , а затем освобождает люциферин , и зеленый флуоресцентный белок (димер, 34 + 53 кДа, ε = 4,3 × 10 4 моль л -1 см -1 , квантовый выход флуоресценции = 0,7–0,9). Биолюминесценция возникает из последовательности реакций, показанных в реакциях [V] — [IX] и включает перенос заряда между зеленым флуоресцентным белком и оксилюциферином кишечнополостного в возбужденном состоянии . Ген люциферазы Renilla был клонирован и использован для получения рекомбинантной люциферазы для исследовательского использования. Кроме того, ген зеленого флуоресцентного белка ( gfp ), выделенный из биолюминесцентного Renilla , стал широко использоваться для экспрессии генов как in vivo, так и in vitro :

[V]
(PAP = аденозин 3 ‘, 5′-дифосфат; PAPS = аденозин- 3′-фосфат 5’-фосфосульфат)

[VI]
[VII]
[VIII]
[IX]
Визуализирующие исследования с использованием трансгенных крыс с репортерным геном
А. Кимура , Э. Кобаяси , в Энциклопедии нейробиологии , 2009 г.

Визуализирующие исследования с использованием генов двойного репортера
Получение изображений in vivo в реальном времени с использованием системы Люц – люциферин — привлекательный инструмент для различных биомедицинских исследований, но он имеет некоторые подводные камни. Во-первых, сигнал люминесценции, испускаемый небольшим количеством клеток, не может быть обнаружен извне у живых животных даже с помощью высокочувствительных устройств визуализации, тогда как минимальное количество клеток, необходимое для обнаружения, зависит от интенсивности экспрессии Luc. Во-вторых, в системах визуализации in vivo клетки, меченные Luc, изображаются как плохо окаймленные области . Гистологические исследования после экспериментов по визуализации in vivo могут частично решить эти проблемы; однако ферментативная активностьЛюка теряется в фиксированных экземплярах. В-третьих, клетки, меченные Luc, не подходят для анализа проточной цитометрии , в отличие от клеток, меченных GFP.

Для решения этих проблем мы разработали трансгенных крыс с двойным репортерным геном. Наши трансгенные крысы, которые экспрессируют отдельные репортерные гены, такие как Luc, LacZ и GFP, являются инбредными линиями крыс Льюиса. Таким образом, мы можем получить крыс с двойной меткой, скрещивая эти линии друг с другом. Когда Luc-трансгенные крысы Lewis были скрещены с GFP-трансгенными крысами Lewis, гибридное потомство ((Luc × GFP) F1 крысы) представляло собой источник клеток с двойной меткой Luc-GFP. Эти клетки с двойной меткой можно применять не только для визуализации in vivo, но и для анализа проточной цитометрии ( рис. 4 (а) ). Таким же образом гибридные крысы (Luc × LacZ) предоставляют клетки с двойной меткой Luc-LacZ, которые можно визуализировать путем окрашивания X-gal после периода визуализации in vivo ( рис. 4 (b)).).

Войдите, чтобы загрузить изображение в полном размере
Рисунок 4 . Визуализация in vivo с использованием трансгенных крыс с двумя репортерами: (а) BMC, полученные от крысы (Luc × GFP) F1, трансплантированные летально облученным крысам Lewis дикого типа; (b) гепатоциты, полученные от крысы (Luc × LacZ) F1, трансплантированные в воротную вену гепатектонизированных крыс Lewis дикого типа. На рисунке (а) представлена ​​репрезентативная схема люминесцентной визуализации in vivo (слева) и анализов проточной цитометрии GFP-положительных клеток периферической крови через 30 дней после трансплантации (справа). На (b) представлена ​​типичная схема люминесцентной визуализации in vivo (слева) и окрашивания X-gal печени реципиента (справа). BMC, клетки костного мозга; GFP, зеленый флуоресцентный белок.

Ферменты-маркеры / репортеры
Хён-Мён Ын , в Enzymology Primer для технологии рекомбинантной ДНК , 1996 г.

б. Особенности подложки
(я)
Светлячок люциферазы требует D (-) — люциферин [( S ) -4,5-дигидро-2- (6-гидрокси-2-бензотиазолил) -4-тиазолкарбоновой кислоты] в качестве субстрата. Фермент ингибируется дегидролюциферином или L (+) — люциферином, который реагирует с АТФ с высвобождением PP i , но не подвергается дальнейшим светоизлучающим реакциям ( 58 ). Люциферин не проницаем для липидных мембран в обычных условиях анализа с нейтральным pH, когда карбоксильная группа ионизируется. В зависимости от клеток-хозяев следующие подходы могут помочь уменьшить ограничение субстрата in vivo. Кислые буферы, удерживающие люциферинв неионизированной форме или в нейтральной среде (pH 7,2), дополненной агентами, улучшающими проницаемость (например, 1% Me 2 SO) и / или детергентами (например, 0,01% Tween-20), облегчают проникновение субстрата в клетки. Альтернативно и более эффективно производные люциферина можно использовать в качестве субстратов in vivo . Например, этерификация с помощью DMNPE [1- (4,5-диметокси-2-нитрофенил) диазоэтан] и образование DMNPE «замкнутого» люциферина позволяют быстро уравновесить эфир люциферина в клетке ( 62 ). Затем сложный эфир люциферина превращается в люциферин либо фотолизом, либо эндогенными эстеразами , что позволяет стабильно измерять активность люциферазы.

(ii)
Люцифераза светлячков имеет особую потребность в АТФ. Концентрация АТФ 2 мМ оптимальна для обычных анализов, в которых возникает вспышка света, за которой следует снижение светового производства. Двухфазный временной ход производства света переключается на монофазное постоянное производство света (в течение> 5 мин) в присутствии нескольких цитидиновых нуклеотидов , например, CTP, CDP, dCTP, dCDP, ddCTP и CTP, окисленного периодатом (oCTP) ( 63 ). Окисленный периодатом АТФ (оАТФ) и оАДФ также вызывают образование монофазного света. Обратите внимание, что светопродукция при низких концентрациях АТФ (<10 мкМ) практически постоянна и на нее не влияют модулирующие соединения. CMP и цитидин ингибируют Luc или неэффективны в изменении паттерна вспышек. КоА и родственные соединения также изменяют времяход светопродукции и усиления сигнала до четырехкратного. Активирующие эффекты соединений приписываются более быстрой диссоциации ингибирующего продукта (оксилюциферина) от фермента и / или диссоциации АТФ от аллостерического сайта связывания фермента. Эффекты двух активаторов не складываются.

Специфичность к АТФ позволяет проводить анализы Luc в присутствии других NTP и NDP. Действительно, эта специфичность позволяет использовать люциферазу светлячков в качестве чувствительного реагента для анализа АТФ ( 64 ). В элегантном приложении in vivo анализ АТФ используется как быстрый метод для различения лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых микобактерий после трансформации бактерий (клинических изолятов) фагами-репортерами люциферазы ( 65 ).

(iii)
Микромолярные концентрации неорганического PP i стабилизируют световое излучение, предотвращая образование комплекса Luc – оксилюциферин ( 66 ). Более высокие концентрации PP i подавляют сигнал, ингибируя связывание АТФ с люциферазой.

(iv)
Некоторые красители и анестетики действуют как конкурентные ингибиторы. Принцип субстратной конкуренции на сайте гидрофобного связывания фермента был использован в качестве чувствительного анализа для амфипатических веществ в субнаномолярных концентрациях ( 67 ).

Фенилбензотиазол, который является аналогом субстрата , является конкурентным ингибитором. При введении in vivo это соединение защищает люциферазу от протеолитической деградации и приводит к более чем 10-кратному увеличению активности Luc ( 68 ).

Концептуальные основы и биоэнергетические / митохондриальные аспекты онкометаболизма
Симоне Патерньяни , … Паоло Пинтон , в » Методы энзимологии» , 2014 г.

2.1 Измерение внутриклеточной концентрации АТФ с помощью люминесцентного ридера
В этом методе люминесценция зависит от наличия люциферина , и она пропорциональна перфузией люциферина концентрации, от 20 до 200 мкм M . Световое излучение пропорционально концентрации АТФ в образце.

Протокол позволяет измерять уровни АТФ с помощью рекомбинантной целевой люциферазы в самых разных типах клеток (например, HeLa, HEK 293T, CHO, COS-7, SH-SY5Y, A7r5, PC12, эмбриональные фибробласты мыши (MEF), а также первичные культуры нейронов и миотрубок скелетных мышц).

Источник https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/luciferin